Пермские исследователи разработали инновационный метод диагностики нейродегенеративных заболеваний.

Статья опубликована в Journal of Chromatography A. Исследование осуществлено при поддержке Российского научного фонда.

В настоящее время для определения содержания аминокислот в различных жидкостях применяется метод высокоэффективной жидкостной хроматографии с использованием флуоресцентных или ультрафиолетовых детекторов. Суть метода заключается в том, что анализируемая смесь помещается в колонку, заполненную специальным веществом. В процессе анализа компоненты смеси разделяются и выходят из колонки по очереди в детектор, который фиксирует их появление в виде пиков. Эта последовательность пиков называется хроматограммой.

Для того чтобы флуоресцентный детектор смог обнаружить анализируемое вещество, оно должно ярко светиться при облучении, однако большинство природных аминокислот (например, серин) не обладают такими свойствами. Поэтому с использованием реагентов они химически метятся флуорофором – соединением, способным испускать свет при облучении.

Часто в качестве такого реагента использовали дансилхлорид. Однако продукты его реакции с аминокислотами нестабильны, что существенно снижает точность измерений. Для решения этой проблемы применяют его аналог – дабсилхлорид. Ранее считалось, что его нельзя использовать для обнаружения аминокислот флуоресцентным методом, так как он «гасит» свечение, и детектор ничего не «видит». Тем не менее, политехники обнаружили, что поглощение света дабсилхлоридом настолько сильное, что он подавляет даже фоновое излучение, причем так сильно, что сигнал детектора опускается ниже базовой линии, и на хроматограмме появляются так называемые отрицательные пики. По ним, как и по положительным, также можно определить наличие искомого вещества.

Ученые Пермского Политеха решили проверить возможность применения такого метода для поиска D-аминокислот и сравнить его с традиционным – ультрафиолетовым. Для этого они взяли несколько растворов, содержащих смесь L- и D-серина, и записали хроматограмму с помощью ультрафиолетового и флуоресцентного детекторов.

«На первом детекторе мы зафиксировали обычные пики, направленные вверх, а на втором – вниз. При этом глубина пика пропорциональна содержанию аминокислоты, что позволяет проводить количественный анализ. Эксперимент повторяли несколько раз для пяти концентраций серина в диапазоне от 0,01 до 0,08 мг/мл, что соответствует реальным количествам аминокислот в биологических образцах. Мы установили, что погрешность определения D-серина ультрафиолетовым и флуоресцентным детектором практически одинаковая и не превышает 8% для наименьшей концентрации (0,01 мг/мл) и менее одного процента для максимальной концентрации (0,08 мг/мл)», – комментирует Леонид Аснин, доцент кафедры «Химия и биотехнология» ПНИПУ, кандидат химических наук.

Полученные результаты указывают на то, что флуоресцентный метод эффективен для выявления D-аминокислот наравне с ультрафиолетовым. Это позволяет проверять результаты анализа различными методами и повышать их точность.

Метод пока протестирован на модельных растворах, но будет адаптирован для реальных биологических жидкостей, таких как спинномозговая жидкость или плазма крови, а также для нервных тканей животных. Тогда его можно будет использовать в медицине и нейрофизиологии для изучения нейродегенеративных заболеваний и метаболических процессов в мозге.

Результаты исследований ПНИПУ помогут в разработке методов объективной диагностики (по содержанию D-аминокислот в биологических образцах) социально значимых заболеваний, таких как болезнь Альцгеймера, болезнь Пика или дисциркуляторная энцефалопатия.